【深度讲解】细胞因子家族的老大哥——干扰素
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干扰素是细胞因子中最早被发现的。1957年，研究人员观察到如果易感的动物细胞暴露在单一病毒环境，这些细胞能很快获得病毒抗性。这种抗性是由被感染细胞分泌出的物质引起的，该物质被命名为“干扰素”。后续研究发现，大多数物种都能产生各种干扰素，人体能产生至少三种不同的干扰素。
这些干扰素可有不同的细胞产生，并实现不同的生物功能，包括：
l 诱导细胞产生病毒抗性
l 调节免疫功能
l 调节细胞的生长和分化
l 维持某些物种的怀孕早期
没有一种干扰素能够实现上面所有的生物活性，干扰素通过结合到细胞膜上的特定受体起作用。
干扰素都有哪些？
干扰素(IFN)属于糖蛋白。目前在人类身上共发现α、β、γ三种类型：α型干扰素(IFN-α)是由白细胞产生的；β型干扰素(IFN-β)是由成纤维细胞(纤维母细胞)产生的；γ型干扰素是(IFN-γ)由免疫系统中的T细胞和自然杀手细胞产生的。所有的这三种都是有效的病毒抑制剂，并具有一定的抗癌作用。
IFN-α和-β具有30%的氨基酸序列同源性，都具有酸稳定性，结合的受体相同，并能介导相似的生物活性，因此，IFN-α和-β在某些时候被称为I型干扰素，或者“酸稳定干扰素”。IFN-γ明显区别于其他干扰素，它结合的受体和介导的生物活性都不相同，所以也经常被称为II型干扰素。
干扰素的医学意义
根据干扰素的生物活性，大部分的干扰素可用于医学治疗，包括：
l 增强抗感染的免疫应答；
l 治疗某些自身免疫疾病；
l 治疗某些癌症
直到20世纪70年代，随着细胞培养技术的发展，特异性表达IFNs的水平有所增加。然而直到遗传工程技术的出现，干扰素的产量才逐渐满足纯化和治疗的需求。
表1. 人类干扰素及其产生细胞
干扰素家族 | 别称 | 家族成员数 | 产生细胞 | |
IFN-α | Leukocyte IFN, B cell IFN, lymphoblast IFN | >15 | 淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞 | |
IFN-β | Fibroblast IFN, IFN-β-1 | 1 | 成纤维细胞，一些上皮细胞 | |
IFN-γ | Immune IFN, T cell IFN | 1 | T淋巴细胞，NK细胞 | |
图1. Interferon Alfa-2a
之前很多年IFN-α被认为是单一基因产物，实际上各种物种都可以产生多种相关的IFN-α。人体中至少有24个相关基因，他们可以表达至少16种不同的成熟IFN-αs。其中15种又可以被分为I型IFN-αs，一个II型。
I型IFN-αs由166个氨基酸组成，II型IFN-αs有172个氨基酸组成。在刚合成时都含有额外的23个氨基酸信号肽。pI在5-6.5之间。异质性分析表明，尽管大多IFN-αs不进行糖基化，有糖基化的主要是O-糖基化。IFN-αs成员间的同源性超过70%，富含亮氨酸和谷氨酸，成熟体基本都含有2个二硫键。它们的四级结构含有一些α螺旋，但缺乏β折叠。
每个单独的IFN-α家族成员都有单独的名字，通常是在α后面加一个字母或者一个数字，比如IFN-αA，IFN-αB，IFN-α7，IFN-α2B，有些会同时有两个名字，比如IFN-α7和IFN-αJ1是同一个产品。
图2. Interferon beta
IFN-β通常由成纤维细胞分泌，它是第一个被纯化的干扰素。IFN-β含有166个氨基酸残基，一个二硫键，它的糖蛋白通常超过20kDa。它的侧链通过N-糖苷键与天冬氨酸残基连接。IFN-β的四级结构主要由5个α螺旋组成，其中3个相互平行，另外两个与它们反平行。
图3. Interferon gamma
IFN-γ通常作为“免疫”干扰素，主要由淋巴细胞分泌，它首次是从人外周血淋巴细胞中提取出来的。IFN-γ与I型IFN的同源性较低，成熟的多肽含有143个氨基酸，大概17kDa,根据不同的糖基化会呈现不同的分子量大小。它的四级结构含有6个α螺旋。
研究发现两种I型IFN受体。两个都是跨膜的N-糖蛋白。其中一个受体IFN-α/β-受体能结合所有的I型IFNs，另一个αβ-受体特异性的结合IFN-αB。这两类受体在大多数细胞中存在。
IFN-γ受体（II型受体）在细胞中的分布要少于I型受体，它是一个50kDa大小的糖蛋白，在细胞膜上以二聚体的形式起作用。IFN-γ受体的胞外部分由大约200个氨基酸组成，并且需要另一个跨膜糖蛋白（AF-1）协助起作用。
I型和II型受体的结合各自的IFNs后在胞内触发的信号传导通路非常相似，为JAK-STAT通路。这个信号通路近几年研究的很多，它几乎立刻就在信号通路的传到中占据了重要的位置，不仅仅是针对干扰素，还包括了其他的一些细胞因子的信号通路。
这里不单独介绍JAK-STAT信号通路，具体介绍一下干扰素如何通过JAK-STAT信号通路进行信号传导。
I型干扰素结合到IFN-α/β手提上可以磷酸化并激活JAK家族的两个成员：Tyk2和JAK1。这些激酶进一步磷酸化STAT1α（STAT91），STAT1β（STAT84）和STAT2（STAT113）。这三个激活后的STATs从受体上分离，与细胞之内的蛋白p48结合，然后这个复合体进入到细胞核内，直接结合到IFN敏感基因的上游调控区（ISREs），进而调控特定基因的表达。
图4. Interferon gamma signaling pathway
以IFN-γ为例，IFN-γ与II型受体相结合，使受体二聚化，激活JAK1和JAK2。JAKs磷酸化受体并与STAT1α结合，STAT1α与受体分离后形成同源二聚体并移动到了细胞核内。它可以通过结合特定的上游调控区GAS调节IFN-γ的敏感基因。PIAS-1蛋白是这个信号通路的抑制剂，它可以结合磷酸化的STAT1，抑制DNA的结合和激活。
如同之前介绍的，干扰素有各种各样的生物活性，I型和II型干扰素的生物活性不同。I型干扰素主要与抗病毒活性相关，同时它们对一些细胞具有抗增殖功能，包括某些肿瘤细胞。这种抗肿瘤效果可能并不只是直接通过抗增殖起作用，I型IFNs可以提高NK细胞和T毒性细胞活性，通过他们识别并破坏肿瘤细胞。并不是所有I型的应答反应相同，干扰素结合到同样的受体上，引起的生物活性反应不同，不同干扰素引起抗病毒活性和抗肿瘤活性的比例不同。这些反应的分子机制还未研究清楚。
IFN-γ主要调节免疫和炎症应答，它能促进大部分细胞的激活，生长和分化。IFN-γ代表主要的巨噬细胞活化因子，从而增强巨噬细胞介导的效应，包括：
l 破坏入侵的微生物
l 破坏细胞内的病原体
l 肿瘤细胞细胞毒性
l 促进主要组织相容性复合体（MHC）抗原表达，从而提高淋巴细胞激活IFN-γ结合多形核中性粒细胞表面受体，促进了中性粒细胞表面IgG的Fc部分结合蛋白表达，极大地提高的这些细胞吞噬和细胞毒性的活性。
IFN-γ可以通过影响T和B淋巴细胞的生长，分化和功能直接调节免疫应答，这个调节过程很复杂，经常需要其他的生长因子的配合。IFN-γ对于一些T细胞亚群以自分泌方式充当生长因子，同时能够抑制其他T细胞类型的生长。对未成熟的B淋巴细胞群的发育具有抑制作用，但可以支持成熟的B细胞存活。 它可以在各种情况下上调和下调抗体产量。所有的干扰素都可以提高I型MHC表面抗原的表达，II型MHC抗原表达主要由IFN-γ激发。
现在我们已经解开了部分IFNs调节的分子机制，特别是抗病毒活性部分。IFN激活JAK-STAT信号通路，可以诱导合成30种以上的不同基因产物，其中很多能配合抑制病毒复制。这种抗病毒基因产物大部分是酶类，其中最重要的是2’-5’ 寡腺苷酸合成酶（2,5-An synthetase）和eIF-2α蛋白激酶。
下周同一时间放送《I型干扰素诱导的信号通路》讲解，敬请关注！
干扰素的抗病毒，抑制增殖活性和调节免疫及炎症应答的生物活性，使得他们拥有明显的医疗应用潜力，有几种干扰素制剂已获得最终批准临床使用。
表2. 已通过批准的干扰素相关产品
产品名称 | 公司 | 适用症 |
Intron A (rIFN-a-2B) | Schering Plough | 癌症，生殖器疣，肝炎 |
PegIntron A (PEGylated rIFN-a-2B) | Schering Plough | 慢性丙肝 |
Viraferon (rIFN-a-2B) | Schering Plough | 慢性乙肝、丙肝 |
ViraferonPeg (PEGylated rIFN-a-2B) | Schering Plough | 慢性丙肝 |
Roferon A (rhIFN-a-2A) | Hoffman–La-Roche | 毛细胞白血病 |
Actimmune (rhIFN-g-IB) | Genentech | 慢性肉芽肿疾病 |
Betaferon (rIFN-b-1B, differs from human protein in that Cys 17 is replaced by Ser) | Schering AG | 多发性硬化症 |
Betaseron (rIFN-b-1B, differs from human protein in that Cys 17 is replaced by Ser) | Berlex Laboratories and Chiron | 复发，缓解多发性硬化症 |
Avonex (rhIFN-b-1A) | Biogen | 复发多发性硬化症 |
Infergen (rIFN-a, synthetic type I interferon) | Amgen (USA) Yamanouchi Europe | 慢性丙肝 |
Rebif (rh IFN-b-1A) | Ares Serono | 复发/缓解多发性硬化症 |
Rebetron (combination of ribavirin and | Schering Plough | 慢性丙肝 |
Alfatronol (rhIFN-a-2B) | Schering Plough | 乙肝、丙肝和多种癌症 |
Virtron (rhIFN-a-2B) | Schering Plough | 乙肝、丙肝 |
Pegasys (PEGinterferon a-2A) | Hoffman La Roche | 丙肝 |
Vibragen Omega (rFeline interferon-o) | Virbac | 兽医（降低犬死亡率/临床症状细小病毒） |
尽管干扰素很多潜在的治疗应用早在1950s就被提出，但当时产量过低，从血液制品中大规模的纯化仍然不可行，其医学应用被推迟了很久。而且由于IFNs有物种选择性，导致人类干扰素制药只能来源于人。直到20世纪70年代后期，通过哺乳动物细胞培养技术，IFN的产量有所提高。另外，杂交瘤技术促进了IFN免疫测定的发展。
Namalwa细胞系（人淋巴母细胞特异性菌株）是干扰素的主要工业来源。 细胞在大型动物细胞发酵罐中繁殖（最高可达8000升），随后加入诱导病毒（通常是仙台病毒）导致产生大量的白细胞干扰素。 随后的分析表明这些干扰素由至少八种不同的IFN-α亚型组成。Wellferon是一个已获得批准产品的商品名称。 它由大规模哺乳动物（类淋巴母细胞）细胞培养产生，粗制品经历色谱纯化，包括两个免疫亲和步骤。 最终产品含有9种IFN-α亚型。
重组DNA技术也有助于生产大量足以满足潜在医疗需求的IFN。 20世纪80年代，大多数的IFN基因在多种表达系统中进行克隆和表达。 这种特定基因的表达可生产含有单一IFN（亚）型的产物。
现在大多数IFN已经可以在多种表达系统中产生，包括大肠杆菌，真菌，酵母以及一些哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和猴肾细胞系。目前在医学上使用的大多数IFN是在大肠杆菌中产生的人（rh）重组产物。虽然大肠杆菌不能进行翻译后修饰，但在大多数情况下是没有影响的，因为大多数人类IFN-α以及IFN-β，通常不被糖基化。虽然IFN-γ被糖基化，但大肠杆菌来源的非糖基化产物表现出与天然人蛋白质相同的生物学活性。
在重组微生物系统中产生IFN显然意味着任何最终的IFNs产品污染物在本质上将是微生物。因此产品需要高度的净化以最小化这种非人类物质的存在。大多数IFN最终产物制剂在99％纯度水平。这种纯度水平是通过连续的色谱纯化来实现的。凝胶过滤和离子交换是经常使用的技术，已报道的各种亲和柱层析IFN纯化方案也经常使用，例如使用抗IFN单克隆抗体，活性染料或凝集素（用于糖基化干扰素）对IFNs进行亲和纯化。羟基磷灰石，金属亲和性和疏水性相互作用色谱也可以用于纯化IFNs。FPLC或HPLC技术可以提高并加快产品的纯化率。免疫分析常用于检测和定量下游的干扰素加工，产品（特别是成品）通常也要受到的相关的生物测定。