神经生长因子和血管内皮生长因子在上皮性卵巢癌中表达及意义研究

卵巢肿瘤是妇科常见肿瘤，有研究发现，神经生长因子（NGF）蛋白及其受体在上皮性卵巢癌组织中呈高表达，并且，NGF既可以独立地作为促血管生成因子发挥作用，也可以提高上皮性卵巢癌组织中血管内皮生长因子（VEGF）的水平。在浆液性卵巢癌血管内皮细胞中，NGF与VEGF的共存提示了NGF介导的VEGF表达增加可能是一种肿瘤细胞自分泌式行为。本文研究NGF与VEGF在上皮性卵巢癌组织中的表达及相关性，探讨其在上皮性卵巢癌发生、发展过程中的意义及作用机制。

1.1    一般资料    选择2012—2015年在杭州市第一人民医院行手术切除并经病理确诊为上皮性卵巢癌标本60例设为研究组，选择同期19例行宫颈癌手术患者术中切除的正常卵巢组织为对照组进行研究。按2014年FIGO卵巢癌、输卵管癌及腹膜癌的国际标准及国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会（UICC/AJCC）标准，对60例卵巢癌患者行TNM分期，其中Ⅰ期15例，Ⅱ期18例，Ⅲ期16例，Ⅳ期11例；浆液性状囊腺癌合并部分子宫内膜样腺癌9例，浆液性状囊腺癌20例，子宫内膜样腺癌合并部分浆液性腺癌5例，黏液腺癌20例，子宫内膜样腺癌2例，透明细胞癌2例，浆液性腺癌合并部分移行细胞癌2例。研究组年龄25~63（45.5±2.5）岁，对照组患者年龄25~56（ 42±2.1）岁。两组年龄等基线资料比较差异无统计学意义，具有可比性。所有患者均在知情同意下签署相关协议，自愿参与本次研究，并得到本院医学伦理委员会批准。

1.2    方法

1.2.1    免疫组化法    卵巢组织标本用10%福尔马林液将其固定。将浸泡后的标本制成4~6μm的切片，进行免疫组织化学分析。其中抗-NGF来源于小鼠单克隆抗体，抗-VEGF来源于兔单克隆抗体（美国Santa Cruz生物技术公司），按1∶100比例进行稀释，染色。使用55i显微镜（尼康）观察切片。切片的计数由3名技术人员进行。每份切片各需计数250个细胞。染色强度记为0=无染色，1=弱，2=中等，3=强。

1.2.2    细胞转染    细胞株A2780生长于含10%胎牛血清的1640培养基中，37℃、5% CO2加湿培养箱中常规培养。构建NGF有效靶点shRNA及阴性对照NC，收集病毒液感染A2780细胞株，同时将所获得的能稳定表达shRNA及NC的细胞株，仍用含10%胎牛血清的1640培养基，37℃、5%CO2加湿培养箱中常规培养，实验分组为：shRNA组、NC组、normal组。

1.2.3    Western-blotting方法    分别提取各组细胞总蛋白，BCA法行蛋白浓度测定，上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育过夜，TBST清洗、二抗杂交、TBST清洗，最后行ECL电化学发光检测。

1.3    统计学处理    采用SPSS 23.0统计软件进行分析，采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1    NGF及VEGF蛋白在卵巢组织中的表达    研究组中NGF蛋白表达率为100%，中等到强度染色占37%，对照组中NGF蛋白表达率为74%，中等到强度染色率为16%，研究组与对照组NGF蛋白表达量比较差异有统计学意义（P=0.004）。见表1、图1。研究组中VEGF蛋白表达率为100%，中等到强度染色率78%（47/60）；对照组中VEGF蛋白的表达率为84%（16/19），中等到强度染色率为31%（6/19），两组比较差异有统计学意义（P=0.027）。卵巢癌组织中NGF及VEGF的蛋白表达量明显高于正常卵巢组织，差异有统计学意义。

2.2    Western-blotting检测NGF和VEGF的蛋白水平    NGF shRNA表达株与正常细胞株比较差异有统计学意义（P=0.001），NGF shRNA组表达株对NGF蛋白表达抑制率为40%，NC组抑制率19%；VEGF蛋白量的表达与NC组及normal组比较差异有统计学意义（P=0.001），NGF shRNA组中VEGF蛋白的表达抑制率为38%。

NC组与normal细胞对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。NGF shRNA组中NGF与VEGF 蛋白表达相关显著，差异有统计学意义（P=0.001）。       

以β-actin条带作为内对照，使用Image J 1.441软件分析灰度值的蛋白条带如图2所示。

卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一，70%~80%的卵巢癌患者发现时已为晚期。其中上皮性卵巢癌最常见，占85%~90%。卵巢癌的治疗主要是以手术为主的综合治疗，随着手术及化疗技术的进步，上皮性卵巢癌5年生存率由以往的30%上升至50%，但因为其早期诊断难度大，对二线化疗药物欠敏感等原因，仍是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的一类。

Dissen等用免疫组化的方法测定NGF两种受体（p75NTR和TrkA）在小鼠卵巢中的表达和分布，在阻断NGF基因表达的小鼠动物模型中发现，初级卵泡数目减少，他们认为NGF是初级卵泡生长所必需的，NGF及其受体也参与卵泡的变异分化过程。近年来，逐渐发现NGF及其受体在前列腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌中均有不同程度地表达，作用也因细胞类型的不同而异：（1）在食管癌、垂体泌乳素瘤、神经母细胞瘤中，NGF能抑制增殖并促进其分化。（2）在不同病理类型的乳腺癌中NGF及其受体表达水平有差异，乳腺癌能自分泌和旁分泌NGF，促进癌细胞增殖。（3）在胰腺癌中NGF的作用因TrkA/p75比例不同而异，比例升高时，NGF刺激癌细胞的生长，比例降低时抑制增殖或诱导凋亡。有研究发现，NGF能够促进基底膜降解酶的分泌，提高酶的活性，从而协助恶性肿瘤侵袭过程。本实验免疫组化分析，发现上皮性卵巢癌组织中NGF蛋白表达量均明显高于正常卵巢组织，差异具有统计学意义，提示NGF参与了上皮性卵巢癌的发生、发展过程。

本研究显示，VEGF与NGF的表达存在显著相关性，在NGF高表达的上皮性卵巢癌组织中，VEGF的表达量也明显高于正常卵巢组织，差异有统计学意义。VEGF是一种肝素结合性双价糖蛋白，是迄今为止所发现的最重要的促血管生成因子，肿瘤的生长、浸润和转移依赖于肿瘤血管生成，VEGF能刺激血管内皮细胞增生、分裂，诱导新生血管形成，并可增加微血管通透性，引起血浆蛋白外渗，诱导蛋白水解酶的形成，降解细胞外基质，为增殖灶的形成提供必要的途径和血供。已有研究证实所有的卵巢癌组织中VEGF呈高表达。近来研究发现，NGF既可独立地作为促血管生成因子发挥作用，也可提高上皮性卵巢癌组织中VEGF的水平，在浆液性卵巢癌的血管内皮细胞中，NGF与VEGF的共存现象提示，NGF介导的VEGF表达增加可能是一种肿瘤细胞自分泌行为。但是另有体外研究发现，NGF是通过增强基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达，增强血管内皮的上皮细胞生长侵袭和索带形成，从而起到促进新生血管的作用。有学者研究了NGF与受体p-trkA在卵巢浆液性恶性肿瘤组织中的表达，提示NGF与p-trkA之间的作用可以影响VEGF的表达，从而有促血管生成作用，但是仍未设计转移机制的研究。本文结果与前面研究结论一致，提示NGF最终可通过促进肿瘤细胞血管的生成来影响肿瘤的生成。（参考文献略）