金属螯合高流速琼脂糖层析介质(IDA)(Chelating seplife 6FF)IDA

镍螯合高流速琼脂糖层析预装柱是在工厂里预先将镍螯合高流速琼脂糖装进空柱里，这样保证了装填的均一性，柱效的稳定性，又能方便纯化人员摸索工艺条件，进而保证了结果的稳定性，同时也省去反复拆装工序，节省了时间及人力物力。预装柱由空柱管、上下筛板、塞头分布器、上下堵头、柱帽及层析填料组成，空柱管采用生物兼容PP材质，无毒性，具有生物学惰性，筛板为PE材质,层析填料是亚氨基二乙酸基键合在高流速琼脂糖凝胶上，再螯合金属离子Ni2+形成的一种亲和层析介质，利用样品组分中的组氨酸与金属离子的亲和吸附进行分离纯化，应用于分离能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白及带His 标签的重组蛋白。

1ml（预装柱）、5ml（预装柱）

对于通过AKTA系统纯化用户可直接链接预装柱使用，对于一般手动紫外检测用户，利用鲁尔接口可将蠕动泵、软管、预装柱、核酸检测仪器连接使用，也可将几个预装柱首尾相串联使用，达到更优纯化效果。

4.1平衡

镍螯合高流速琼脂糖层析预装柱用2～5个柱体积的初始缓冲溶液进行平衡。

建议线性流速为100 cm/h。（线性流速=体积流速×60÷柱横截面）

4.2上样

4.2.1样品一般溶解于pH6～8的初始缓冲液中。提高上样缓冲液的pH值可以增大载量。

4.2.2缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐，同时最好避免巯基乙醇、DTT等还原剂。

4.2.3常用缓冲液有10～100mmol/L磷酸钠缓冲液、20～200mmol/LTris-HCl缓冲液等。

4.2.4缓冲液中一般要加入0.15～0.5mol/L的NaCl以消除离子交换作用。

4.2.5初次使用镍螯合琼脂糖凝胶时，推荐使用50mmol/L PBS（50 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl,pH 7.4）作为初始缓冲液。

4.3洗脱

洗脱一般分为以下几种方法：

4.3.1降低pH洗脱：大多数蛋白在pH 6～4会被洗脱下来（也可以在pH 3～4），缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸和磷酸盐缓冲体系。

4.3.2竞争性洗脱：线性增加或一步增加同金属离子有亲和力的竞争物质的浓度（如0～0.5mol/L咪唑、0～50 mmol/L组氨酸、0～2mol/L(NH4Cl）。

4.3.3螯合剂洗脱：EDTA、EGTA 等螯合剂可同金属离子产生作用力，导致蛋白被洗脱下来。此法不能分离不同的蛋白，还会影响蛋白的吸附，导致融合蛋白无法挂柱。

备注：初次使用时，如不确定洗脱需要的咪唑浓度，推荐在初始缓冲液中分别加入10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L咪唑，浓度从低到高分别洗脱和收集重组蛋白，之后通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱结果。

咪唑为碱性，相应缓冲液配制后需要用HCl调节pH值。

降低pH洗脱和螯合剂洗脱会使得金属离子脱落，下次使用前需要重新螯和金属离子。

有条件的可以进行咪唑梯度线性洗脱以确定较佳的洗脱条件。

上述洗脱方法，均须在缓冲液中加入150～500mmol/L的NaCl以消除离子交换作用。

5.1预装柱再生

5.1.1多次使用后或需要更换螯合的金属离子时，必须将凝胶脱镍再生。脱镍方法：用5～10个柱体积的蒸馏水淋洗柱子，再用5～10个柱体积的100mmol/L EDTA淋洗柱子，最后用2～3个柱体积的0.5mol/L NaCl洗掉残留的EDTA。

5.1.2多次使用的柱子脱镍后一般需要进行清洗。清洗方法：用0.1～1.0 mol/L NaOH反向清洗柱子，50 cm/h保持1～2 h，能去除结合强的杂质，同时也能去除热源。

5.1.3清洗后需要重新螯合金属离子。螯合方法：用2～5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍后的柱子，用0.1～0.3mol/L金属盐溶液过柱5～10个柱体积以螯合金属离子，之后用5～10个柱体积的蒸馏水淋洗以去除未螯合的金属离子。

5.2在位清洗

5.2.1去除因离子交换作用吸附的蛋白：2～3个柱体积的2mol/L NaCl溶液反向清洗。

5.2.2去除强疏水性蛋白和脂质等：4个柱体积的70%乙醇或者30%异丙醇反向清洗。

5.2.3除去蛋白沉淀、疏水性蛋白：参照凝胶再生步骤。

6.1使用时保证柱子和缓冲液的温度一致，避免柱床内产生气泡，影响纯化效果。

6.2预装柱长时间不用需用20%乙醇水溶液过柱，保存在4～8℃，不能冷冻柱子。

6.3 2～25℃,常压,避光运输。

6.4仅供科研实验使用。