景乃禾组建立空间转录组测序新方法丨BioArt推荐

BioArt按：2 月 16 日， Nature Protocols 在线发表了中国科学院生物化学与细胞生物学研究所细胞生物学国家重点实验室景乃禾研究组的最新研究成果“Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq”。该研究工作建立了一种可以获得具有空间位置信息的少量细胞转录组图谱的技术方法。该文通讯作者为景乃禾研究员与彭广敦副研究员。

论文解读：

 无论是体内组织还是体外的细胞系，不同的细胞之间都存在着个体差异性，即细胞的异质性。 常规的基因表达分析方法依赖数目巨多的细胞或者组织，这种群体性的分析得到结果是平均化之后的细胞反应，会掩盖细胞间的差别；然而在许多时候，单个细胞的异质性对解释肿瘤的发生（肿瘤起初产生或者发生转化的时候是隐藏的，变化的细胞极其稀少）、干细胞或前体细胞的多能性与谱系分化（干细胞均一性不一致，存在多能性与分化潜能的差别，典型的例子胚胎干细胞Nanog表达有很高的异质性）、干细胞与微环境的相互作用（细胞与微环境的协同变化，成体干细胞的静息与激活等）、精准医疗（不同患者的细胞耐药差别）以及免疫肿瘤互作等等都具有十分重要的意义。 

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近些年，单细胞测序技术特别是从 2010 年由汤富酬建立的单细胞转录组测序技术出现以来(Tang et al., 2010; 2011)，各种针对单个细胞的转录组、基因组、甲基化修饰等研究层出不穷， 呈现爆炸式的发展，迅速成为当前生物医学研究内最为火热的技术手段和分析方法之一。 2013 年， Nature Method 把单细胞测序列为年度技术（Method of the Year）（下图）。精准医疗也由于单细胞技术的带动而进入一个日趋激动人心的时代。 

然而，目前单细胞测序的方法在收集单个细胞的时候，抑或通过流式分选（FACS或者MACS），抑或通过微流控捕获（代表方法Fluidigm的C1），抑或通过显微操作／机械式挑选（如玻璃针口吸法），都需要将组织细胞先行打散变成单细胞，也都会丢失细胞在体内原有的位置信息，并且在体外进行单细胞捕获耗时较长，细胞内的分子活动尤其是转录组在离体环境下可能也会发生一些细微的改变。空间位置信息，或者细胞在组织中天然的状态在研究过程中其实具有十分重要的价值，特别针对某些研究领域，如发育生物学（不同位置的细胞接受不同的信号浓度梯度、响应不同的外界刺激，具有不同的发育命运）、肿瘤生物学（肿瘤组织与癌旁组织的区别，肿瘤细胞侵润过程中肿瘤细胞的变化与对正常细胞的影响，肿瘤转移的不同过程阶段等）、脑神经科学（不同脑区位置的神经元结构、神经连结，中间神经元投射，突触前后，神经胶质相互影响等等），细胞来源的位置信息是极为关键的决定因素。

在Geo-seq发展出来之前，人们可以通过原位杂交或者原位的荧光染色对一些基因表达的空间分布进行研究，这是一种较为低通量和较难掌握的研究方案。2014年，加州理工大学蔡龙（Cai Long）实验室发展了针对单个细胞的多重荧光FISH方法，可以同时检测上百个基因的原位杂交信号，大大的提高了研究的通量(Lubeck et al., 2014)；类似的，哈佛大学庄小威实验室发展了单分子成像技术，MERFISH(multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization)，也提高了荧光原位杂交的通量，实现了单细胞水平上空间分辨的多重化RNA分析(Chen et al., 2015)。不同于这些基于原位杂交的方法，2016年，瑞典卡洛琳斯卡学院在Science上报道，通过将大脑切片覆盖在连接有锚定引物的矩阵芯片（Array）上，并消化神经细胞使得细胞通透性增大，细胞中的mRNA直接与锚定引物结合，实现了在大脑切片上的原位转录组测序(Ståhl et al., 2016)，进一步提高了空间位置基因表达分析的技术。然而，多重荧光FISH成本高，仍然需要提前选定待检测的基因，依赖高灵敏度的显微镜；原位测序的方法精度有限，获得到的表达基因和效率也不太理想，技术应用还需要一些优化。

相对而言，Geo-seq采用了一种直观的方法，即所见即所得，通过激光显微切割在组织上直接捕获细胞，每个获取的样本都保留了位置信息。通过与单细胞转录组测序技术桥接，可以在最少5个细胞的样本上进行，完成了一种高效率、高分辨率的空间转录组分析。

Geo-seq流程图

在此方法建立前， allen 脑科学研究所曾经使用激光切割讲多个切割的组织样品集中在一起进行过基因芯片分析(Hawrylycz et al., 2012; Miller et al., 2014)，但集中多个激光切割的样品除了基因芯片自身的限制、 对重复样本要求多、耗时耗力之外，还会使得分析的灵敏度大大降低。 2014 年也有结合激光切割与单细胞转录组的方案(Zechel et al.,2014)，但他们获得表达基因数量低，重复性也不理想。

建立Geo-seq过程中，最为挑战的是实现激光切割的极限少量细胞的稳定、高效RNA-seq，需要摸索样本的处理与样本切割后RNA抽提匹配单细胞测序。为此，，并尝试了多种切割细胞的裂解处理方法，得到了一种简单易行、重复性高的条件组合，与此前基于激光切割的转录组分析方法相比，获得的基因表达数量和测序质量均大大提高；结合激光显微切割上的荧光模块，Geo-seq可以应用到更多的功能分析之中。 

经过大量的实验证明， Geo-seq是一种高效、高分辨率的空间转录组分析方案，既可用于转录图谱的三维重建，也可以用于研究具有特殊结构的少量组织或细胞的转录组信息。利用 Geo-seq 技术，景乃禾课题组在 2016 年发表在Dev Cell上的工作中， 绘制了小鼠早期胚胎原肠运动中期精细的三维分子图谱，并揭示了小鼠细胞谱系蓝图建立过程中的空间转录组特征、转录因子和信号通路调控网络(Peng et al., 2016)。 

图例：对小鼠原肠运动中期胚胎三维分子图谱的绘制，使得早期胚胎发育不同胚层的分化（例如大脑、骨骼及肺分别代表的外胚层、中胚层、内胚层）有了空间定位，相当于提供了一套详细的参考坐标系。任何外源的干细胞通过对照此参考坐标系，即能确立其未来的发育潜能和分化命运。

原肠运动中，多能性的上胚层细胞通过胚胎上的不同位置，发育成为差异较大的外、中、内三个胚层，并且各个胚层不同位置区域细胞也具有与其位置相一致的器官发育设定，例如外胚层是神经与表皮的前体来源，依照在原肠运动胚胎中的位置关系，从前至后的外胚层对应发育为前脑、中脑与后脑。因此， 胚胎中的空间位置就如同旅行家手中的航海地图或探险家的地球仪，对细胞命运的决定研究具有无可比拟的重要功能。

景乃禾课题组的工作，不仅实现了对小鼠胚胎>20000个基因的一次性原位杂交（该项目建立的数据库网站为www.itranscriptome.org），而且建立了一整套体内胚胎发育的空间坐标系统，类似于全球定位系统（Global Positioning System），用作体内体外干细胞的发育分化的参考，因此该项工作受到发育生物学和干细胞届的热评。目前，Geo-seq技术也已成功应用于小鼠大脑发育、肝脏肿瘤学以及人的精子发育等研究中。未来随着该技术以及更多基于空间位置的分析技术应用到更加复杂的生物系统中，将能够还原生物过程尤其是生理、病理状态下组织和器官层面重要的分子动态特征，将目前的分子生物学研究从三维（时间加XY二维空间）推展到思维（时间加XYZ空间）的状态。

参考文献：

Chen, K.H., Boettiger, A.N., Moffitt, J.R., Wang, S., and Zhuang, X. (2015). RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science 348, aaa6090–aaa6090.

Hawrylycz, M.J., Lein, E.S., Guillozet-Bongaarts, A.L., Shen, E.H., Ng, L., Miller, J.A., van de Lagemaat, L.N., Smith, K.A., Ebbert, A., Riley, Z.L., et al. (2012). An anatomically comprehensive atlas of the adult human brain transcriptome. Nature 489, 391–399.

Lubeck, E., Coskun, A.F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., and Cai, L. (2014). Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods 11, 360–361.

Miller, J.A., Ding, S.-L., Sunkin, S.M., Smith, K.A., Ng, L., Szafer, A., Ebbert, A., Riley, Z.L., Royall, J.J., Aiona, K., et al. (2014). Transcriptional landscape of the prenatal human brain. Nature 508, 199–206.

Peng, G., Suo, S., Chen, J., Chen, W., Liu, C., Yu, F., Wang, R., Chen, S., Sun, N., Cui, G., et al. (2016). Spatial Transcriptome for the Molecular Annotation of Lineage Fates and Cell Identity in Mid-gastrula Mouse Embryo. Developmental Cell 36, 681–697.

Ståhl, P.L., Salmén, F., Vickovic, S., Lundmark, A., Navarro, J.F., Magnusson, J., Giacomello, S., Asp, M., Westholm, J.O., Huss, M., et al. (2016). Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science 353, 78–82.

Tang, F., Barbacioru, C., Nordman, E., Li, B., Xu, N., Bashkirov, V.I., Lao, K., and Surani, M.A. (2010). RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nature Protocols 5, 516–535.

Tang, F., Lao, K., and Surani, M.A. (2011). Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nature Methods 8, S6–S11.

Zechel, S., Zajac, P., Lönnerberg, P., Ibáñez, C.F., and Linnarsson, S. (2014). Topographical transcriptome mapping of the mouse medial ganglionic eminence by spatially resolved RNA-seq. Genome Biology 15, 486.

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