论着|苏飞:汉黄芩素对肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移及侵袭的影响

摘要：目的  探讨汉黄芩素对肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法  肝癌细胞SMMC-7721分为5μmol／L汉黄芩素组、10μmol／L汉黄芩素组、20μmol／L汉黄芩素组和空白对照组。5、10、20 μmol／L汉黄芩素组分别加入5、10、20 μ_mol／l.汉黄芩素进行处理，空白对照组不进行任何处理。处理48 h后，采用MTT法检测各组细胞增殖率，采用TUNEL法检测各组细胞凋亡率，采用划痕试验检测各组细胞划痕愈合率，采用Transwell侵袭试验检测各组侵袭细胞数，并进行比较。结果  处理48 h后，20 μmol／L汉黄芩素组细胞增殖率[(46.8±4.5)%]、划痕愈合率[(38.3±2.1)%]和侵袭细胞数[(16±7)个]明显低于5μmol／I．汉黄芩素组[(93.5±2.3)%、( 73.3±4.6)%、(24±2)个]、10μmol/l)汉黄芩素组[(58.3±6.2)%、(47.8±3.6)%、(19±5)个]和空H对照组[100. 0%、100.O%、(29±8)个]，10μmol/L汉黄芩素组低于5 μmol/L汉黄芩素组和空白对照组，5 μmol／L汉黄芩素组低于空白对照组，差异均有统计学意义( P<O. 05)；20  μmol／L汉黄芩素组细胞凋亡率[(27.3±3.6)%]明显高于5 μmol／L汉黄芩素组[(8.8±5.3)%]、10 μmol／L汉黄芩素组[(1 6.1±3.7)%]和空白对照组[(4.6±2.1)%]，10 μmol／L汉黄芩素组高于5μmol／L汉黄芩素组和空白对照组，5 μmol／L汉黄芩素组高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 汉黄芩素可抑制肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力，诱导其凋亡。

关键词：肝癌；汉黄芩素；增殖；迁移；侵袭

1.1一般材料  肝癌细胞株SMMC-7721（中国科学院上海细胞库），SMMC-7721细胞使用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基于37℃、体积分数5% C02培养箱中培养。将肝癌细胞SMMC-7721分为5μmol／L汉黄芩素组、10 μmol／L汉黄芩素组、20 μmol／L汉黄芩素组和空白对照组。5、10、20μmol／L汉黄芩素组分别给予5、10、20μmol／L汉黄芩素处理48 h，空白对照组不进行任何处理。

1.2方法

1.2.1  仪器与试剂  四甲基偶氮唑盐( MTT)、丝裂霉素C（美国Amresco公司），TUNEL试剂盒（美国Roche公司），Matrigel胶（美国BD公司），Transwell小室（美国Comning公司）。Biotek酶联免疫分析仪（美国Beckman公司），荧光共聚焦成像显微镜、倒置显微镜（日本Olympus公司），电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2.2   MTT法检测肝癌细胞增殖能力  将肝癌细胞按4 000个／孔密度种入96孔板内，每孔100 μL，培养过夜；待细胞贴壁后，同步化处理12 h。加入各组处理因素，并预留空白对照孔和对照孔。每组设6个复孔，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，pH一7.4，PBS配制）后，对照孔不含细胞但加入等体积MTT，继续在培养箱中孵育3.5 h。每孔加入1 500 μL DMSO，振荡15 min;应用酶联免疫分析仪测量各孔590 nm波长吸光度值，以空白对照孔调零。计算细胞增殖率，细胞增殖率(%)一（实验组吸光度值一对照组吸光度值）／对照组吸光度值×100%。

1.2.3TUNEL法检测肝癌细胞凋亡情况  将玻璃片用肥皂水反复清洗后泡酸过夜，去离子水多次冲洗并高压灭菌，烘干后备用。将SMMC-7721细胞按2×105个／孔密度种入24孔板内，培养过夜；待细胞贴壁后，同步化处理12 h。分别加入处理因素，继续孵育48 h。按罗氏试剂盒说明书配制质量分数1%通透液和体积分数4%多聚甲醛。采用体积分数4%多聚甲醛固定1h，PBS漂洗5 min×3次。按罗氏试剂盒说明书配制TUNEL反应液，整个过程冰上操作。滴加反应液于每张细胞爬片，使反应液完全覆盖细胞区域。37℃避光湿育th，PBS漂洗5 min×3次。将上述配制的DAPI母液稀释为1 mg／L后滴加于玻片，37℃避光湿育10 min，弃DAPI，PBS漂洗5 min×3次。防淬灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察，避开玻片周边区域，随机选取3个视野并计数，细胞核出现染色质边集、浓缩、核碎裂等改变即为凋亡细胞。激光共聚焦显微镜下拍照。

1.2.4划痕试验检测肝癌细胞迁移能力  将细胞种人6孔板内，待细胞长满后，PBS清洗1遍，同步化处理12 h。在皿底部划一条直线，使用200 μL移液管在培养皿中分别划3条平行划痕，使划痕垂直于培养皿底部的直线。PBS反复冲洗，将划掉的细胞洗掉后拍照，对拍照位置进行标记，并将时间记为Oh。分别加入不同处理因素和丝裂霉素C，使其每皿中均含2mg／L丝裂霉素C。将划痕后的6孔板孵育48 h后，每次对同一划痕位置拍照。划痕与培养皿底部直线相交处为拍照点。测量每个时间点所对应划痕两侧的细胞间距(lum)，即以Oh划痕边沿距离减去48 h划痕边沿距离作为细胞迁移距离，计算划痕愈合率，划痕愈合率(%)一（Oh划痕距离-48 h划痕距离）/0 h划痕距离×100%。

1.2.5Transwell侵袭试验检测肝癌细胞侵袭能力

　　将Matrigel胶1：10稀释后取50 μL铺于上层小室内，整个过程冰上操作。待胶干透后，水化备用。细胞按照2×10 5个／孔种入Transwell孔板的上室内，孵育过夜，待细胞贴壁后，同步化处理12 h。分别于下室中加入不同处理因素，孵育48 h。按照前述方法配制体积分数4%多聚甲醛和质量分数1%结晶紫。用棉签轻轻擦拭掉上室内细胞，体积分数4%多聚甲醛固定Transwell小室底面细胞。结晶紫染色10 min，PBS漂洗5 min×3次。倒置显微镜下观察，避开周边区域，每孔随机选取3个视野照相并计数。

1.3  统计学处理  应用GraphPad Prism 5．O软件进行数据录入和统计分析，计量资料以均数±标准差(z±s)表示，比较采用单因素方差分析，组间比较采用q检验；检验水准α=0. 05，

2.1  4组肝癌细胞增殖率比较  处理48 h后，20μmol／L汉黄芩素组细胞增殖率明显低于5、10pmol／L汉黄芩素组和空白对照组，10 μmol／L汉黄芩素组低于5 μmol／L汉黄芩素组和空白对照组，5 μmol/L汉黄芩素组低于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2  4组肝癌细胞凋亡率比较  处理48 h后，20 μmol/L汉黄芩素组细胞凋亡率明显高于5、10μmol／L汉黄芩素组和空白对照组，10 μmol／L汉黄芩素组高于5μmol／L汉黄芩素组和空白对照组，5 )umol／L汉黄芩素组高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1及图1。

2.3  4组肝癌细胞划痕愈合率比较  处理48 h后，20μmol／L汉黄芩素组细胞划痕愈合率明显低于5、10 )umol／L汉黄芩素组和空白对照组，10 )umol／L汉黄芩素组低于5μmol／L汉黄芩素组和空白对照组，5μmol／L汉黄芩素组低于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1及图2。

2.4  4组肝癌细胞侵袭细胞数比较  处理48 h后，20 μmol／L汉黄芩素组细胞侵袭细胞数明显低于5、10 μmol／L汉黄芩素组和空白对照组，10 μmol／L汉黄芩素组低于5 μmol／L汉黄芩素组和空白对照组，5μmol／L汉黄芩素组低于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1及图3。

　　汉黄芩素是一种从中药黄芪中提取的黄酮类化合物，其可通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成及协同抗癌剂促进肿瘤细胞死亡等作用。汉黄芩素对乳腺癌MCF-7、骨肉瘤细胞U-2 0S、及肺癌细胞A549等细胞均可起抑制生长、促进凋亡等作用。肿瘤细胞的增殖、迁移及转移侵袭能力是决定肿瘤发病与恶性程度的主要原因，其机制复杂，涉及细胞外信号转导通路、肿瘤细胞微环境及各种生长因子等。本研究MTT实验结果显示，20 μmol／L汉黄芩素组细胞增殖率低于5、10 )umol／L汉黄芩素组和空白对照组，说明5～20  μmol／L均为汉黄芩素有效浓度，在其范围内均可抑制肝癌细胞生长，且汉黄芩素对肝癌细胞的抑制作用有时间和剂量依赖性，随作用时间延长和作用浓度增加，抑制作用明显增强。

　　TUNEL实验结果显示，20μmol／L汉黄芩素组细胞凋亡率明显高于5、10μmol／L汉黄芩素组和空白对照组，提示汉黄芩素可促进肝癌细胞凋亡，且不同浓度汉黄芩素对肝癌细胞凋亡作用有剂量依赖性。划痕试验及Transwell侵袭试验结果显示，20μmol／L汉黄芩素组划痕愈合率及肝癌细胞侵袭细胞数明显低于5、10μmol／L汉黄芩素组和空白对照组，提示汉黄芩素可有效降低肝癌细胞的侵袭转移能力，且具有剂量依赖性。

　　本实验通过体外培养肝癌细胞SMMC-7721，给予不同实验条件观察了肝癌SMMC-7721细胞的常见生物学行为的变化。本研究结果提示，汉黄芩素能抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖、迁移及侵袭能力并促进其凋亡，但其是通过何种通路进行调控还有待于进一步研究。