通过培养基优化降低色氨酸氧化水平

包括单克隆抗体在内的多种生物药已经被批准应用于癌症、炎症等多种疾病的治疗。由于抗体蛋白的分子复杂性，它们必需通过生物宿主进行生产，其中使用最广泛的即CHO细胞，而化学限定性（Chemically Defined, CD）培养基的应用已成为新的趋势。相较于传统的培养基，CD培养基不含动物血清和蛋白水解物，能够最大程度避免批次间差异，保持与管理预期的一致性。礼来公司在一种生物药开发过程中，将传统含有水解物的培养基升级为CD培养基，将抗体产量提升了40%。但遗憾的是，后期LC-MS肽谱分析显示，该抗体蛋白互补决定区（Complementarity Determining Region, CDR）中色氨酸氧化水平出现了明显提升，本文通过优化CD培养基来改善色氨酸氧化水平，提升抗体蛋白质量。

氨基酸的氧化会改变抗体蛋白的二级及三级结构，从而影响后者的生物学性能，包括生物活性的下降，半衰期的缩减，以及免疫原性聚合体的形成。抗体CDR区能够专一性的识别并结合特异性抗原，此区域色氨酸氧化直接关系到抗体药生物活性的下降。因此色氨酸氧化问题是保证产品质量亟待解决的。

生物药的生产需要经历一系列的上游和下游工艺，这些工艺过程均会对蛋白的后期修饰造成不同程度的影响。但针对本文讨论的色氨酸氧化问题，研究主要集中在上游生产，尤其是细胞培养基对蛋白翻译后修饰，主要基于以下原因：

1. 在细胞培养过程中发生色氨酸氧化的概率最大，因为在下游纯化工艺或成品存储过程中其相对丰度并不会改变；

2. 由于DNA序列和宿主细胞株已经确立，蛋白和细胞基因工程技术的应用受到了限制；

3. 细胞培养工艺参数的优化并不能有效缓解色氨酸氧化问题；

4. 传统含水解物的培养基和CD培养基中某些成分的含量变化非常大，可能会对色氨酸氧化水平产生影响。

众所周知，培养基成分的改变能够对细胞代谢产生影响，细胞中的氧代谢会产生活性氧自由基（Reactive Oxygen Species, ROS），过量的ROS会损害机体功能，比如人体内过量ROS的存在会导致心血管疾病、神经性疾病甚至癌症；而ROS也是导致细胞内抗体蛋白氧化降解的直接因素。通过对比传统和CD基础培养基/流加培养基的配方，基于成分浓度变化大和文献报道中对氧化反应发挥作用这两个方面，确立了四个研究对象：色氨酸、半胱氨酸、铜（硫酸铜）、锰（氯化锰）。实验方案和后期分析方法如下表所示。

各个独立因素对于Product A色氨酸氧化水平的影响

在确定了研究对象后，首先通过对比色氨酸和半胱氨酸分别在传统和CD基础培养基/流加培养基中的浓度，结果如表1所示。在CD培养基和流加物中色氨酸浓度较低，仅为传统培养基的0.7x/0.4x倍，而CD流加物中半胱氨酸的水平比传统流加物中高。通过向CD基础培养基/流加培养基中添加色氨酸使其达到传统培养基水平，和向传统流加培养基中添加半胱氨酸使其达到CD流加培养基水平，来比较他们对色氨酸氧化水平的影响。

当提升CD基础培养基/流加培养基中色氨酸的浓度到传统水平，细胞生长状态（图 2A）和抗体蛋白产量（图 2B）没有发生明显变化，而色氨酸氧化水平却下降了27%（图 2C）。而后续实验表明，如果继续提高色氨酸浓度则会对细胞生长和抗体产量产生抑制。

当传统流加培养基中半胱氨酸的浓度提升到CD水平，细胞生长状态（图 3A）和抗体蛋白产量（图 3B）没有发生明显变化，但是色氨酸氧化水平却提升了34%（图 3C）。可见升高流加培养基中半胱氨酸水平会增加色氨酸氧化。

基于此发现，为进一降低色氨酸氧化水平，将CD流加培养基中半胱氨酸进一步降低，测试含有不同浓度（1x; 0.75x; 0.5x）半胱氨酸的CD流加培养基。

实验结果显示，在对细胞生长状态（图 4A）和抗体蛋白产量（图 4B）无明显影响的前提下，半胱氨酸浓度的逐级下降使色氨酸的氧化水平出现了计量依赖性的下调（图 4C）。由于半胱氨酸是细胞生长代谢的必需氨基酸，为了保证细胞生长和产量，并没有探究更低浓度半胱氨酸条件。综合以上实验结果，CD基础培养基/流加培养基中色氨酸浓度的提升，以及CD流加培养基中半胱氨酸浓度的下调，均能够有效缓解Product A色氨酸氧化问题。

根据之前文献报道，虽然铜和锰均以痕量水平存在于传统培养基和CD培养基中，但都能影响胞内氧化反应。为探索它们对色氨酸氧化水平的影响，分别提升铜和锰的浓度进行测试，实验结果如图5所示。从中可以看出，无论铜亦或锰浓度的提升，均对细胞生长状态和抗体蛋白产量没有负面影响，但是各条件下Product A色氨酸氧化水平分别下调了29%和47%。

联合四种因素优化CD培养基

通过以上实验已经发现通过单独调节色氨酸、半胱氨酸、铜离子或锰离子浓度均可显著影响目的蛋白色氨酸氧化水平。联合这四种因素对终产品色氨酸氧化水平影响如何？是否对其他产品色氨酸氧化水平也会产生影响？根据上述实验，配制新配方的CD基础培养基和流加培养基（增加CD基础培养基中色氨酸、铜离子和锰离子浓度；增加CD流加培养基中色氨酸浓度，降低CD流加培养基中半胱氨酸浓度），并将其用于生产Product A和Product B。

对于分别表达Product A和Product B的细胞株实验结果显示，在优化CD培养基中细胞前期生长速率高于对照组（图 6A；图 7A），但最终抗体蛋白产量均与对照组一致（图 6B；图7B）。而Product A色氨酸氧化水平下降了62%（图 6C），其效果优于任意单因素条件下的缓解作用；Product B色氨酸氧化水平下降到可检测水平以下（图 7C）。可以看出，针对于表达Product A细胞株设计的优化CD培养基有更好的缓解色氨酸氧化效果，并且该培养基也能够成功的应用于表达Product B细胞株。

5L生物反应器中验证结果与摇瓶水平实验结果类似，在优化CD培养基中细胞前期生长速率高于对照组（图 8A），但最终收获活率和产量均与对照组类似（图 8B, C）。而Product A色氨酸氧化水平下降了67%（图 8D）。

对Product A其他产品质量的影响

将对生物反应器中表达的Product A进行产品质量全面分析。结果如表2和表3所示

通过表2可以看出，相较于对照组，实验组Product A纯度基本没有变化，而酸性峰含量下降了约8%，相应的主峰含量上升了约8%；在糖型结构方面（表3），Product A在两组条件下的糖型基本保持一致。整体的产品质量参数均符合对于Product A产品质量预期。而对于摇瓶水平Product B产品质量分析结果与Product A一致（文中未提供数据）。

抗体蛋白中氨基酸的氧化常常导致产品免疫原性的改变，甚至改变抗体的生物学活性。在制剂中防止抗体氧化常用添加抗氧化剂的方法，如在最终制剂中加入蛋氨酸等。但本文检测的色氨酸氧化更多的是发生在细胞培养阶段，因为后期纯化和制剂稳定性检测过程中，并未发现色氨酸氧化水平的进一步提高。通过提升培养基中色氨酸的浓度可以显著降低终产品色氨酸氧化水平，推测可能的原因是过量的色氨酸可以竞争性的被氧化，而降低了终产品中色氨酸的氧化水平。但是过高的色氨酸浓度则会抑制细胞生长，并导致最终产量的降低。

ROS是细胞培养过程中产生氧化的主要因素。半胱氨酸、以及铜、铁在内的过渡态金属都能够影响ROS水平，并影响目的蛋白的氧化。细胞内低价过渡态金属参与了ROS的形成，其中Fenton反应是存在最普遍的产ROS反应之一。本文利用硫酸铜作为铜的来源，高浓度二价铜的存在不仅抑制了痕量一价铜发挥的还原作用，还能够在电子传递链中接受电子，从而抑制了ROS的产生。而二价锰参与的电子传递链能够消耗细胞内的活性氧（图 9），进而缓解了抗体蛋白色氨酸氧化。半胱氨酸作为还原剂能够将高价过渡态金属还原至低价过渡态金属，后者进而参与催化Fenton反应，产生ROS。而本文将CD流加培养基中半胱氨酸浓度下调，间接抑制了ROS的产生。

综合以上信息，本文探究并确立了缓解两种生物药产品色氨酸氧化的方法：提升CD基础培养基/流加培养基中色氨酸浓度；下调CD流加培养基中半胱氨酸浓度；上调CD基础培养基中铜离子、锰离子浓度。而联合以上四种因素所配制的优化CD培养基对于下调产品色氨酸氧化水平有着更显著的效果，并且对产品的其他质量属性没有负面影响。

参考文献：

Hazeltine, L. B., et al. (2016). Biotechnology Progress 32(1): 178-188.

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